Биотин



Исторические сведения



Почти 100 лет назад Wilidiers показал, что для обеспечения жизнедеятельности дрожжевых клеток в искусственную питательную среду необходимо внести какое-то органическое вещество (фактор роста). Этот фактор роста он предложил назвать «биосом» (от греч. «bios» — жизнь). Изучение природы «биоса» привело к заключению, что «биос» представляет собой комплекс факторов роста, отличающихся друг от друга по физико-химическим свойствам. Экстракты, содержащие «биос», при обработке уксуснокислым свинцом разделялись на две биологически активные фракции. Фракция, выпадавшая в осадок, была названа «биос I», а фракция, остававшаяся в растворе, получила название «биос II». В 1928 г. «биос I» был выделен из чая и идентифицирован как инозит. В 30-х годах «биос II» подвергался тщательному изучению и был разделен на две фракции методом адсорбции— «биос IIа» и «биос IIв».

Kogl предложил назвать «биос IIв» прото «биосом II» или биотином, а фракцию «биос IIа» — «биосом III». В 1935—1936 гг. Kogl и Tonnies впервые выделили кристаллический биотин из желтка яиц. Для этой цели они использовали 250 кг желтков яиц и получили 100 мг биотина с температурой плавления 148°С. Позже было найдено, что некоторые виды Rhizobium требуют для своего роста какое-то органическое вещество, присутствующее в культурах Azotobacter, в гидролизованных дрожжах и других естественных источниках. Это вещество получило название «коэнзим Р». Сравнительное изучение действия на рост Rhizobium «коэнзима Р» и кристаллического препарата биотина показало, что оба вещества обладают одинаковыми биологическими свойствами. Таким образом, было доказано, что биотин является жизненно необходимым для разных видов микроорганизмов, но оставалось неизвестно, нуждаются ли в нем животные.

В 1927 г. Boas показала, что искусственный рацион, содержащий большое количество сухого яичного белка, через 3—4 недели скармливания вызывает у крыс сложный синдром, характеризующийся дерматитом и нервно-мышечными расстройствами. Было установлено, что в сыром картофеле, молоке и печени содержится вещество, предохраняющее животных от развития токсикоза, вызванного избытком яичного белка. В дальнейшем выяснилось, что специфические патологические явления, развивающиеся при приеме пищи, богатой яичным белком, могут быть вызваны не только у крыс, но и у цыплят, морских свинок, собак и обезьян.

В 1931 г. Gyorgy в опытах на крысах обнаружил, что ряд естественных источников содержит вещество, предохраняющее животных от заболевания, вызываемого избытком белка яиц, и предложил назвать его витамином Н. Буква Н была предложена как первая буква немецкого слова Haul — кожа с целью отметить характерные свойства этого витамина, заключающиеся в предохранении кожи от специфического поражения. В серии работ Gyorgy было показано, что наиболее богатыми источниками витамина Н являются печень, почки, дрожжи и в меньшей степени молоко коровы. В 1939 г. он получил препарат витамина Н из печени. В процессе изучения физико-химических свойств препаратов витамина Н и распространения его в естественных источниках возникла мысль об идентичности витамина Н и биотина. Экспериментальная проверка показала, что наиболее очищенные препараты витамина Н полностью заменяют коэнзим Р при испытании на культурах Rhizobium trifohi и биотин при испытании на дрожжах. С другой стороны, коэнзим Р или биотин полностью заменял витамин Н при испытании на животных. Кристаллический препарат метилового эфира биотина, полученный Kogl, был применен Gyorgy в опытах на крысах. Введение 1 мг препарата в день на крысу предотвращало развитие симптомов авитаминоза Н при синтетической диете, содержащей белок куриного яйца. Было вычислено, что в 1 мг метилового эфира биотина содержится 10 000 крысиных единиц витамина Н. Таким образом, витамин Н и биотин полностью идентичны. Дальнейшие исследования дали возможность установить химическое строение биотина и осуществить его синтез.



Химические и физические свойства



В 1941 г. du Vigneaud и сотрудники выделили из печени кристаллический препарат метилового эфира биотина, из которого путем омыления щелочью был получен свободный биотин. Эмпирическая формула его была определена как С10Н16О3N2S. На основании изучения продуктов распада биотина эти авторы пришли к выводу, что структура витамина соответствует 2'-кето-3,4-имидазолидо-2-тетрагидро-тиофен-н-валериановой кислоте.

Молекула биотина состоит из имидазолового (А) и тиофенового (В) колец. Гетероцикл можно рассматривать как тиофеновое кольцо, связанное с уреидной группировкой. Структура биотина была подтверждена его полным химическим синтезом. В молекуле имеется три асимметрических атома углерода, что обусловливает существование 8 стереоизомеров.

Биотин образует игольчатые кристаллы с температурой плавления 232°С. В поперечном сечении кристалл представляет собой ромб, острые углы которого равны 55°. Плотность кристаллов 1,41. Молекулярный вес биотина на основе химической формулы равен 214, а на основе рентгеноскопического анализа 245±6. При исследовании кристаллической структуры биотина установлено, что алифатическая цепь находится в цис-положенин по отношению к уреидной циклической группировке. В 1965 г. установлена структура и относительная конфигурация каждого асимметрического центра биотина, а в 1966 г. абсолютная стереохимия витамина.

Биотин хорошо растворим в воде и спирте, трудно растворим в эфире, углеводородах парафинового ряда и несколько лучше в циклогексане, бензоле, галогенизированных углеводородах, спиртах и кетонах (ацетон). Биотин устойчив к действию ультрафиолетовых и рентгеновских лучей. Он разрушается под влиянием перекиси водорода, соляной кислоты, едких щелочей, формальдегида и сернистого газа. Он не изменяется под действием молекулярного кислорода, серной кислоты, гидроксиламина. В ультрафиолетовых лучах для биотина не обнаружено специфической полосы поглощения.

Аналоги и ингибиторы. Молекула биотина обладает большой специфичностью. Это подтверждается тем, что из 8 известных стереоизомеров только один — биотин — обладает биологической активностью. Удаление 4 атомов водорода с сохранением конфигурации молекулы (дегидробиотин) приводит к полной потере активности. Важность уреидной группы подтверждается полной потерей активности при замене ее гуанидиновой группировкой. Столь же необходимо для активности наличие полной боковой цепи биотина. Все соединения, имеющие более длинную боковую цепь (гомобиотин) или более короткую (норбиотин), лишены биологической активности. Замена карбоксильной группы на спиртовую (биотинол, оксибиотинол) сопровождается потерей активности. Только одна группа производных, полученных окислением атома серы (сульфобиотин и биотинсульфоксид) или заменой серы кислородом (оксибиотин) или двумя атомами водорода (дестиобиотин), проявляет биологическую активность. Сульфобиотин заменяет потребность в биотине у некоторых дрожжей, но оказывается антагонистом витамина для L. casei, E. coli и Neurospora.

Известны аминокислотные производные биотина, среди которых наиболее изучен биоцитин, обладающий высокой активностью для многих микроорганизмов. Биоцитин выделен в кристаллическом виде из дрожжей. В 1951 г. расшифрована его структура. Он представляет собой пептид биотина и лизина.

В 1952 г. осуществлен синтез биоцитина. Степень использования биоцитина разными микроорганизмами резко различается. Возможной причиной этого может быть наличие или отсутствие биоцитиназы, которая расщепляет биоцитин с освобождением свободного биотина.

Биологическая активность биотина и его аналогов обусловлена наличием или отсутствием определенных внутримолекулярных связей, что позволяет объяснить причины наличия или отсутствия биологической активности для большинства изомеров и производных биотина. Так, образование водородной связи исключено у всех других оптических изомеров, кроме D-биотина, а также у производных с более длинной или укороченной боковой цепью, что приводит к полной потере биологической активности (гомобиотин, норбиотин). Неактивность гуанидиновых аналогов биотина, биотинола, оксибиотинола также объясняется отсутствием у них водородной связи. Некоторые производные биотина, которые образуются без нарушения водородной связи, сохраняют биологическую активность (дестиобиотин, оксибиотин, биоцитин и ряд аминокислотных производных биотина).

В настоящее время выяснена причина патологических изменений, возникающих при кормлении животных сырым яичным белком. В нем содержится авидин — белок, который специфически соединяется с биотином (введенным внутрь с пищевыми продуктами или синтезированным кишечными микроорганизмами) в неактивный комплекс и тем самым препятствует его всасыванию. Авидин содержится в яичном белке курицы, гуся, утки, индейки. В 1942 г. он выделен в кристаллическом виде и оказался глюкопротеидом с молекулярной массой 70000. Авидин стехиометрически связывает эквимолярные количества биотина, образуя прочный комплекс, который не расщепляется ферментами пищеварительного тракта. Комплекс авидина с биотином термически устойчив и полностью диссоциирует только в автоклаве при 120°С за 15 минут. С авидином соединяется также DL-оксибиотин и некоторые другие аналоги биотина, но сродство авидина к биотину намного больше, чем к его производным. Изучение взаимодействия биотина и его производных с авидином показало необходимость уреидной группы в молекуле витамина, тогда как карбоксильная группа и атом серы не являются необходимыми для образования комплекса. Авидин является универсальным ингибитором биотина. Его способность связывать биотин широко используется при изучении механизма участия этого витамина в процессах обмена веществ. Торможение той или иной биохимической реакции авидином является существенным доводом в пользу возможности участия в ней биотина. Авидин применяется и для получения экспериментальной биотиновой недостаточности у животных.



Распространение биотина в природе



Биотин широко распространен в природе. Он обнаружен у микроорганизмов, растений и животных. Содержание его определено в различных систематических группах животных - от простейших до млекопитающих. Наиболее высокий уровень биотина обнаружен в личинках насекомых, а наименьший у пресмыкающихся. Рекордное количество (6,81 мкг/г) найдено в печени акулы. Содержание биотина в организме животных не зависит от принадлежности животного к определенной систематической группе. Анализ тканей показал большое различие в содержании биотина в органах одного и того же животного. Наиболее богаты витамином печень, почки, надпочечники. Сердце и желудок содержат среднее, а мозговая ткань, легкие и скелетные мышцы — минимальное количество биотина. В таблице приведено содержание биотина в различных продуктах животного и растительного происхождения.



Содержание биотина в пищевых продуктах



Продукты животного происхождения Биотин в мкг на 100 г продукта Продукты животного происхожденияБиотин в мкг на 100 г продукта
Печень свиная 250 Рисовые отруби 46
Печень говяжья 200 Рожь, цельное зерно 46
Почки свиные 180 Земляные орехи 40
Сердце быка 8-50 Пшеничная мука 9-25
Яйцо (желток) 30 Цветная капуста 17
Сардины (консервы) 24 Шампиньоны 16
Ветчина 10 Горошек зеленый 6
Камбала 8 Бананы 4,4
Мясо курицы 6 Дыня 3,6
Говядина 5 Лук свежий 3,5
Молоко коровье 5 Капуста белокочанная 2,5
Сыр 4 Морковь 2,5
Сельдь 4 Апельсины 1,9
Телятина 1,5-2 Яблоки 0,9
Соя, бобы 60 Картофель 0,5-1,0


Наиболее богаты витаминами свиная и говяжья печень, почки, сердце быка, яичный желток, а из продуктов растительного происхождения— бобы, рисовые отруби, пшеничная мука и цветная капуста. В животных тканях и дрожжах биотин находится преимущественно в связанном с белками виде, в овощах и фруктах — в свободном состоянии.



Методы определения биотина



Изолирование биотина из биологического материала и изучение его роли в обмене веществ стало возможным благодаря наличию микробиологических методов количественного определения этого вещества. Микробиологические методы основаны на ростовой реакции организма на биотин, причем интенсивность роста микроорганизмов обычно определяют нефелометрически. Микробиологических методов разработано довольно много, и все они различаются по тест-организмам, процедуре анализа и по способу измерения ростовой реакции. Большое число микроорганизмов требуют для своего роста биотина и многие из них могут быть использованы как тест-организмы. Сюда относятся Cl. butylicum, Rh. trifolii и Neurospora crassa. Наиболее широкое распространение получил метод с использованием L. arabinosis ввиду большой чувствительности и специфичности ее к биотину. Эта бактерия не реагирует на любые аналоги и производные биотина, включая биоцитин.

Большое распространение получил дрожжевой метод определения биотина. Дрожжи являются самыми универсальными организмами в смысле использования различных форм биотина и его аналогов, так как используют биотин, биоцитин, дестиобиотин и др. В качестве тест-организма чаще всего избирают Saccharomyces cerevisiae. В частности, дрожжевой метод с использованием этого вида дрожжей с успехом применяют для определения витамина в очищенных препаратах биотиновых ферментов.



Биоситнез биотина



Биосинтез биотина осуществляют все зеленые растения, некоторые бактерии и грибы. Изучение путей биосинтеза биотина началось после выяснения строения его молекулы. Химическое расщепление биотина проходит через образование дестиобиотина, диаминопеларгоновой кислоты и, наконец, пимелиновой кислоты. Вполне естественно было предположить, что биосинтез биотина может проходить путем постепенного усложнения молекулы пимелиновой кислоты. В пользу этого говорил тот факт, что пимелиновая кислота способна заменять биотин у некоторых микроорганизмов как фактор роста. Она стимулирует синтез биотина, а меченая пимелиновая кислота обнаруживается в углеродном скелете биотина.

Изучение структурной формулы биотина привело к предположению, что атомы 1,1', 4 и 5 происходят из декарбоксилированной молекулы цистеина , атомы 2¢ и 3¢ происходят из карбамоилфосфата и связаны, таким образом, с имеющимся в клетках «пулом» СО2. Остальные семь атомов (2, 3, 6, 7, 8, 9 и 10) происходят из углеродного скелета пимелиновой кислоты. Высказанное предположение подтверждено экспериментально при изучении биосинтеза биотина в культурах Achromobacter, выращенных на синтетических средах, к которым добавляли либо 3- С14 -цистеин, либо NaHС14O3. Синтезированный бактериями радиоактивный биотин расщепляли и изучали распределение в нем радиоактивного углерода. Исходя из полученных результатах была предложена схема синтеза биотина, согласно которой началом синтеза является конденсация пимелил-КоА и цистеина. Затем происходит декарбоксилирование, что приводит к образованию 9-меркапто-8-амино-7-оксопеларгоновой кислоты. Взаимодействие аминогруппы этой кислоты с карбамоилфосфатом вызывает образование уреидного производного, которое после отщепления воды может циклизоваться, давая биотин с характерным для него двойным циклом.

Исследование синтеза биотина у большого числа бактерий, дрожжей и грибов показало, что дестиобиотин является промежуточным продуктом биосинтеза биотина и в свою очередь образуется из пимелиновой кислоты.

По способности синтезировать биотин и дестиобиотин все исследованные организмы делятся на 4 группы:

  • 1 группа: большинство организмов из ряда Mucor, Rhizopus и некоторые другие грибы, которые способны синтезировать большие количества биотина и дестиобиотина из глюкозы в отсутствие пимелиновой кислоты.
  • 2 группа: грибы этих же родов и некоторые из стрептомицетов, у которых пимелиновая кислота и дестиобиотин стимулировали биосинтез биотина.
  • 3 группа: грибы из рода Aspergillus, а также Neurospora crassa, Fusarium bulbigenum и некоторые другие, активно осуществляющие превращение дестиобиотина в биотин.
  • 4 группа: большинство бактерий и некоторые грибы, которые образуют дестиобиотин из пимелиновой кислоты, но не способны превращать его в биотин.

Изучено более 600 штаммов бактерий, использующих углеводороды для синтеза биотина, из которых 35 синтезируют витамин в больших количествах (>100 мкг/мг). Наибольшее количество биотина образует Pseudomonas sp. штамм 5-2 при выращивании на керосине. Специфическим активатором накопления биотина является аденин. Экзогенные пимелиновая и азелаиновая кислоты увеличивают образование биотина из керосина. Лучшими источниками углерода оказались н-алканы с углеродной цепью из 15—20 атомов, в частности н-ундекан. Промежуточными продуктами в синтезе биотина из ундекана являются пимелиновая и азелаиновая кислоты.

Исследование биосинтеза биотина в растениях показало, что каждый орган растения и каждая его клетка синтезируют витамин в эмбриональной фазе своего развития. В дальнейшем синтез замедляется и, по-видимому, прекращается, но содержание его в различных тканях долгое время остается постоянным.



Обмен биотина в организме



Об обмене биотина известно немного. Биотин, поступивший с пищей в связанном состоянии, отщепляется от белка под действием протеолитических ферментов, переходит в водорастворимую форму и всасывается в кровь в тонком кишечнике. В кишечнике происходит также всасывание биотина, синтезированного бактериями желудочно-кишечного тракта. Всосавшийся в кровь биотин связывается с альбумином сыворотки и разносится по всему организму. Наибольшее количество биотина накапливается в печени, почках и надпочечниках, причем у мужчин накапливается биотина несколько больше, чем у женщин.



Содержание биотина в тканях человека



Органы и ткани Биотин в мкг/г
женщины мужчины
Кожа - 0,01
Мозг 0,03 0,08
Легкие 0,02 0,01
Сердце 0,17 0,19
Мышцы 0,02 0,04
Желудок 0,19 0,11
Ободочная кишка 0,08 0,09
Печень 0,62 0,77
Молочная железа 0,04 -
Селезенка 0,04 0,06
Почки 0,58 0,67
Надпочечники 0,35 0,23
Семенники - 0,05
Яичники 0,03 -

Средний уровень биотина в цельной крови составляет 147 нг% (82— 270 нг%). Какой-либо разницы в содержании биотина в крови в зависимости от пола и возраста не отмечено. Содержание биотина в молоке женщины резко изменяется в период кормления. В первый день после родов содержание биотина в молоке невелико и только на 10-й день повышается до 0,33 мкг на 100 мл.

Биотин почти не подвергается обмену в организме человека и выводится в неизмененном виде в основном с мочой. У здоровых людей выведение биотина с мочой составляет 11-183 мкг в сутки. У новорожденных детей оно достигает максимума (4 мкг на 100 мл) на 2-й день жизни и снижается до нуля к 7-му дню. Содержание биотина в кале колеблется от 322 до 393 мкг в сутки. В норме выделение биотина с мочой и калом превышает поступление его с пищей в 3—6 раз, что свидетельствует об удовлетворении потребностей человека в биотине за счет его бактериального синтеза в кишечнике. Через 6 часов после введения человеку массированной дозы биотина большая часть его выводится с мочой. Содержание биотина в кале при этих же условиях изменяется в меньшей степени.

Небольшая часть карбоксильной группы боковой цепи биотина окисляется до СО2 специфической оксидазой, которая обнаружена в печени и почках морской свинки и крысы.

Исследование распределения меченого биотина в тканях цыплят и крыс показало, что уже через 4 часа после выведения физиологической дозы меченного С14 по карбоксильной группе биотина около 16% метки включалось в печень, а 30°/0 выводилось с калом и мочой в неизмененном виде . В сердце, селезенке и легких радиоактивности не обнаружено. Менее 4% введенной дозы выводилось в виде выдыхаемого С14 О2, что указывало на незначительное прямое окисление карбоксильной группы биотина. О распределении меченого биотина в различных клеточных фракциям можно судить по таблице.



Содержание биотина в клеточных фракциях печени нормальных и биотин-авитаминозных крыс



Нормальные животныеАвитаминозные животные
Фракция печениобщий биотин в % связанный биотин в % к общемуобщий биотин в %
Гомогенат 100 92 100
Ядра 37 99 75
Митохондрии 9 89 13
Микросомы 2 23 0
Надосадочная жидкость 47 91 0

Из таблицы видно, что 40—50% радиоактивности обнаружено в надосадочной фракции, полученной после центрифугирования гомогената печени крыс. В микросомах содержится незначительное количество витамина. Большая часть биотина в различных клеточных фракциях, за исключением микросом, присутствует в связанной с белком форме.

Исследование динамики содержания биотина в тканях в онтогенезе животных показало, что яйцо и зародыш в начальной стадии развития наиболее богаты биотином. Развитие зародыша сопровождается снижением содержания биотина в тканях. Исключение составляют печень и почки, в которых содержание биотина значительно повышается в первые дни постэмбрионального развития. В опытах на собаках показано, что содержание биотина в мозге и мышцах, а также включение Н3-биотина в 20—80 раз выше у эмбрионов и 1 — 16-дневных щенят, чем у родивших их самок. В некоторых тканях животных обнаружен биоцитин, который образуется при расщеплении связанного с белками биотина тканедыми протеазами. Бицитин в свою очередь расщепляется биоцитиназой на свободный биотин и лизин. Биоцитиназа найдена и в крови человека , где выполняет, по-видимому, аналогичную функцию.



Участие биотина в обмене веществ и механизм действия



К 1958—1959 гг. накопились данные, которые указывали на участие биотина в реакциях карбоксилирования. Было установлено, что при биотиновой недостаточности нарушаются такие функции печени животных как синтез цитруллина из орнитина, NH3 и СО2, включение СО2 в пурины, карбоксилирование пропионовой кислоты, приводящее к образованию янтарной кислоты, включение СО2 в ацетоуксусную кислоту. Однако механизм действия биотина в этих реакциях оставался невыясненным. Данные опытов с 2-С14-биотином исключали возможность того, что С-атом уреидной группировки биотина переносится в качестве остатка угольной кислоты. Одним из обстоятельств, из-за которых подвергалась сомнению функция этого витамина как кофермента карбоксилирования, было описанное в разное время участие биотина в реакциях, в которых не происходило ни включения, ни отщепления СО2.

Так, было обнаружено влияние биотина на дезаминирование аспарагиновой кислоты, серина и треонина и участие его в синтезе жирных кислот. Первые четкие доказательства коферментной функции биотина в реакции карбоксилирования появились в работах, посвященных именно синтезу жирных кислот. В этих работах отмечалось, что биотин является коферментом ацетил-КоА-карбоксилазы, фермента, осуществляющего карбоксилирование ацетил-КоА с образованием малонил-КоА — первую стадию синтеза жирных кислот. К этому времени были получены доказательства существования еще одного биотинфермента, а именно b-метил-кротонил-КоА-карбоксилазы. Все известные в настоящее время биотиновые ферменты катализируют два типа реакций:

  • I тип: реакции карбоксилирования или фиксации СО2, сопряженные с расщеплением АТФ.
  • II тип: реакции транскарбоксилирования, протекающие без распада АТФ, при которых карбоксилирование одного субстрата осуществляется при одновременно протекающем декарбоксилировании другого соединения.

К началу 60-х годов были выделены и изучены карбоксилазы, осуществляющие указанные превращения. Биотиновые ферменты представляют собой олигомеры с большой молекулярной массой(порядка 700000) и, как правило, содержат 4 моля связанного биотина на 1 моль фермента, т.е. состоят из 4 субъединиц с молекулярным весом 175000, каждая из которых содержит одну молекулу биотина.

Расшифрован и механизм участия биотина в реакциях карбоксилирования. Установлено, что реакции карбоксилирования являются двухстадийными. Первая стадия сводится к образованию «активной СО2» в форме СО2~биотинфермента:

АТФ + НСОз + биотинфермент Û АДФ + Фнеорг. + СО2~биотинфермент.

Вторая стадия заключается в переносе «активной СО2» на акцептор:

СО2~биотинфермент + R2H Û биотинфермент + R2—COO`

Аналогичный двухстадийный механизм предложен и для реакций транскарбоксилирования:

r1—СОО + биотинфермент Û СО2~биотинфермент + R1H;

СО2~биотинфермент + R2H Û R2—СОО + биотинфермент.

После установления существования «активной СО2» в виде СО2~биотинфермента установлен характер связи между СО2 и биотином. Этому способствовало открытие того факта, что b-метилкротонил-КоА-карбоксилаза способна карбоксилировать свободный биотин, переводя его в карбоксибиотин. В дальнейшем меченый карбоксибиотин был выделен в опытах с С14-бикарбонатом и идентифицирован как 1¢-N-карбоксибиотин. Его структура была подтверждена химическим синтезом. К этому времени уже было известно, что в биотиновых ферментах карбоксильная группа биотина соединена с e-NН2-группой лизина ферментного белка ковалентной связью.

Эта структура получила ряд экспериментальных подтверждений и в настоящее время является общепринятой для всех биотиновых ферментов. Реакционная способность углекислоты, связанной с биотином, находит выражение в энергетических взаимоотношениях. Величина свободной энергии распада СО2~биотинфермента равна 4,74 ккал/моль, что дает основание причислить СО2~биотинферменты к «богатым энергией» соединениям.

Карбоксилированные биотиновые ферменты даже при низкой температуре обладают незначительной устойчивостью. Период полураспада СО2~биотинфермента (пропионилкарбоксилаза) при 0° составляет 260 минут, а при 20° лишь 9,9 минуты. Весьма примечательно, что свободный СО2-биотин значительно более устойчив, чем: СО2-биотин в составе фермента. Так, период полураспада СО2-биотина при 20° равен 138 минутам. Установлено, что СО2-биотинферменты чрезвычайно лабильны в присутствии своих субстратов. Возможно, что за этот эффект ответственны конформационные изменения ферментного белка, возникающие в результате присоединения субстрата.

Большой интерес представляет и проблема регуляции активности биотинсодержащих ферментов в организме. В этой связи особенно важны исследования по биосинтезу молекулы биотина и образованию холоферментов из биотина и соответствующего ферментного белка. Данные по первому вопросу изложены в разделе «Биосинтез». Что касается образования холофермента, то можно считать установленным, что во всех биотиновых ферментах биотин связан с e-аминогруппой лизина. Этот способ связи экспериментально доказан почти для всех карбоксилаз и метилмалонил-КоА-оксалоацетаттранскарбоксилазы. Недостаточные по биотину клетки Propionibacterium shermanii содержат апофермент и специфическую синтетазу, которая катализирует при использовании АТФ соединение биотина с апоферментом, приводящее к образованию активного холофермента транскарбоксилазы. Необходимыми кофакторами этой реакции являются АТФ и Mg2+. При использовании очищенных ферментов удалось доказать, что образование холотранскарбоксилазы происходит в два этапа, причем промежуточным соединением является биотиниладенилат (R-CO-5'-АМФ):

Mg2+

1. АТФ + R—СО2Н + синтетаза Û R-СО-5'-АМФ-синтетаза + пирофосфат

(биотин

2. R-СО-5'-АМФ-синтетаза + Н2N-фермент —> R-CO-NH-фермент + 5'-АМФ + синтетаза.

Синтетический биотиниладенилат обладает способностью заменить смесь АТФ, MgCl и биотина при синтезе холофермента .Образование других холоферментов протекает аналогичным образом. Все известные ферментативные реакции, для которых установлено участие биотина в качестве кофермента, являются процессами переноса углекислоты. По-видимому, в обратимом присоединении и отдаче СО2 и состоит исключительная функция этого витамина в обмене веществ. Однако при биотиновой недостаточности нарушаются очень многие реакции обмена веществ в организме. Так, биотин вовлечен в биосинтез белков, дезаминирование аспартата, серина и треонина у бактерий, обмен триптофана, жиров и углеводов, синтез пуринов, образование мочевины у животных и др.

Взаимодействие с другими витаминами. Установлена связь биотина с другими витаминами, в частности с фолиевой кислотой, витамином B12, аскорбиновой кислотой, тиамином и пантотеновой кислотой. Особенно тесные взаимоотношения существуют между биотином и фолиевой кислотой. Сначала было показано, что при недостатке биотина в печени крыс значительно снижено общее содержание веществ, обладающих активностью фолиевой кислоты, и что биотин стимулирует биосинтез этого витамина кишечной флорой. Позднее было установлено, что у биотин авитаминозных крыс значительно снижено содержание коферментных форм фолиевой кислоты, а именно N5- и N¹º-формилтетрагидрофолатов, тетрагидрофолата, N5- и N10-формилтетрагидроптероилглута-миновых кислот. Биотин стимулирует синтез метионина из серина и гомоцистеина и процессы метилирования вообще, способствуя накоплению коферментных форм фолиевой кислоты. Таким образом, при недостаточности биотина нарушена утилизация организмом фолиевой кислоты и превращение ее в активные коферментные формы. Биотин принимает непосредственное участие в ферментативных процессах превращения фолиевой кислоты в ее коферментные производные.

Биотин благоприятно влияет на общее состояние организма и сохранение аскорбиновой кислоты в тканях цинготных морских свинок. В свою очередь аскорбиновая кислота замедляет, хотя и не предотвращает развитие биотинового авитаминоза у крыс. При недостаточности биотина снижается содержание тиамина в печени, селезенке, почках и мозге животных. У крыс, содержавшихся на рационе, лишенном биотина, содержание витамина В12 было выше, чем у контрольных животных, получавших биотин. Эти два витамина тесно связаны между собой в обмене пропионовой кислоты у микроорганизмов и животных. Существует тесная связь между биосинтезом биотина и пантотеновой кислоты у микроорганизмов и зеленых растений. Биотин облегчает симптомы пантотеновой недостаточности и, наоборот, пантотеновая кислота смягчает проявление авитаминоза при недостатке биотина.



Потребность организма в биотине



Биотин необходим для человека, животных, растений и большого числа микроорганизмов. Он является фактором роста для многих штаммов Saccharomyces cerevisiae и других дрожжей, а также многих грибов и бактерий (молочнокислых, пропионовокислых и др.). Однако некоторые дрожжи (Тorulopsis utilus, Hansenila anomala), грибы и бактерии (Aerobacter aerogenes, Proteus vulgaris и др.) способны его синтезировать. Потребность в биотине у птиц и животных покрывается за счет синтеза его бактериями желудочно-кишечного тракта. У коров, овец и лошадей, содержащихся на обычном рационе, практически исключена недостаточность биотина. У свиней и птиц недостаточность биотина может создаваться при использовании кормов, бедных витаминами. Наиболее чувствительны к биотину цыплята, у которых быстрее наступает авитаминоз при содержании их на очищенном рационе. Недостаток биотина в рационе кур-несушек приводит к сильному снижению содержания биотина в яйцах. Из таких яиц развиваются цыплята с врожденным абиотинозом или вообще не выводится жизнеспособное потомство. Для организации правильного кормления кур-несушек нужно, чтобы в рационе содержалось 13 мкг биотина на 100 г корма.

Потребность в биотине у человека покрывается за счет синтеза его микрофлорой кишечника, поэтому ее трудно оценить. С известной долей приближения можно считать, что минимальная ежедневная доза биотина для человека составляет 150—200 мкг, обезьян —20 мкг, крыс — 0,5—3 мкг, цыплят — 0,65—1 мкг, свиней— 100 мкг.

В период беременности и лактации потребность в биотине у женщин повышается до 250—300 мкг в день.



Проявление недостаточности биотина



Наиболее подробно недостаточность биотина изучена в опытах на крысах и цыплятах при скармливании рационов с большим содержанием сырого яичного белка. Биотиновый авитаминоз у животных характеризуется прекращением роста и падением веса тела (до 40%), покраснением и шелушением кожи, выпадением шерсти или перьев, образованием красного отечного ободка вокруг глаз в виде «очков», атактической походкой, отеком лапок и типичной позой животного с согбенной (кенгуру подобной) спиной. Дерматит, который развивается у животных при недостаточности биотина, может быть охарактеризован как себорея десквамационного типа, сходная с той, которая наблюдается у детей. У крыс авитаминоз биотина развивается через 4—5 недель скармливания опытного рациона, а у цыплят первые признаки авитаминоза появляются через 3 недели.

Помимо внешних признаков, биотиновый авитаминоз вызывает глубокие морфологические изменения в тканях и органах, а также нарушения в обмене веществ. Известны изменения в зобной железе, коже и мышцах крыс. Характерны обильный гиперкератоз, акантез и отеки. Разрушенные волосяные стволы перемешаны с гиперкератозными пластинками. Установлено расширение волосяных сумок, отверстия которых закупорены гиперкератозным материалом. В последней фазе развития авитаминоза наблюдается атрофия жира в гиперкератозных пластинках. Недостаток биотина в рационе крыс приводит к уменьшению его содержания в тканях. В печени и мышцах количество витамина снижается в 5 раз, а в мозговой ткани — на 15%. В крови авитаминозных крыс накапливается пировиноградная кислота, развивается ацидоз и снижается концентрация глюкозы. Также у животных развивается креатинурия.

Человек полностью удовлетворяет свою потребность в биотине за счет синтеза его микрофлорой кишечника, поэтому гиповитаминоз можно получить только в эксперименте. Экспериментальную недостаточность биотина у человека вызывали путем включения в диету ежедневно 200 г сырого яичного белка. Через 3 недели появилось шелушение кожи без зуда. На 7—8-й день развилась пепельная бледность кожи и началась атрофия вкусовых сосочков языка. Позднее появились мышечные боли, повышенная чувствительность, болезненные ощущения, вялость, сонливость, тошнота и потеря аппетита. В крови уменьшилось содержание эритроцитов и холестерина. Выделение биотина с мочой снизилось в 7—8 раз против нормы (с 29— 52 до 3,5—7,3 мкг в сутки). Введение 150 мкг биотина уже на 3—4-й день устраняло депрессию, мышечные боли и восстанавливало аппетит.

Таким образом, недостаточность биотина у человека в первую очередь вызывает поражения кожи. Более тяжелые проявления требуют, по-видимому, большей длительности авитаминоза.



Автор статьи: доцент кафедры биохимии МБФ РГМУ, к.м.н. Адрианов Николай Владимирович.
Специально для ООО "Электронная Медицина".